WA 系列恒温水浴

2、细胞传代

当细胞密度达到 80%~90%（过早产量不足，过晚细胞状态不佳，1:2 至 1:10 以上的比率传代培养，一般 1:3 至 1:5 细胞一代，即从细胞接种到分离再培养的一段时间，非细胞有丝分裂次数）时，去掉完全培养基，用 1X PBS 清洗 2 次。

加入胰蛋白酶（注意：消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是 37℃。显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度）进行消化，放入细胞培养箱中约 2-3 min。

加入适量 DMEM 完全培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后 500 g 离心 2min，弃上清液，再加入 DMEM 完全培养基清洗，弃上清液。

加入 DMEM 完全培养基，轻轻吹打混匀，吸取 10 微升进行计数，然后按照所需细胞量在含 5% CO₂ 的细胞培养箱继续培养。
 

WCI 系列二氧化碳培养箱

二氧化碳培养箱专用摇床

超高产率微型细胞工厂

高密度培养专用摇瓶

 

3、细胞冻存

当细胞密度达到 80%~90% 时，去掉完全培养基，用 1X PBS 清洗 2 次。加入胰蛋白酶进行消化，放入细胞培养箱中约 2-3 min。加入 DMEM 完全培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后 500 g 离心 2 min，弃上清液，再加入 DMEM 完全培养基清洗，弃上清液。加入 1 ml 冻存液（90% 胎牛血清，10% DMSO。 一般来讲血清含量可以在 10%-90% 之间调整，冻存液中加入血清一方面可以为细胞提供营养，另一方面可以在细胞冻存过程中提供非渗透性保护物质，如蔗糖，白蛋白等从而更好地保护细胞），放入冻存管内（管内有 yi 丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入 4 ℃ 冰箱中冻存 30 min，然后放入 -20 ℃ 冰箱中冻存 30 min，再置于 -80 ℃ 冰箱内过夜。

第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。 

细胞冻存和复苏的原则是：慢冻速融，这样更加有利于保持细胞的活力。冻存细胞不加任何保护剂，会导致细胞内冰晶的产生，从而使细胞产生内源性的机械损伤，引起细胞内环境渗透压，PH，电解质等的改变，进而促使细胞死亡。
 

WIGGENS 液氮罐系列

冻存管

冻存支架

4、注意事项

（1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS 和胰蛋白酶的瓶子放入 37 ℃ 水浴锅内预热；
（2）用 75% 酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手；
（3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且减少污染；
（4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小；
（5）严格的无菌操作；
（6）贴壁细胞消化适度：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化；
（7）传代细胞所有的操作尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作，每种细胞使用一套器材。避免交叉感染；
（8）传代细胞瓶口每次打开或者关闭都需要在酒精灯上消毒。
 

悬浮细胞培养瓶

贴壁细胞微载体培养瓶

贴壁细胞滚瓶培养